检测培养基是否被污染的方法有？

常用的检测方法有培养法、荧光染色法、PCR法和电镜观察法。

培养法是最为可靠且成本低廉的方法,但培养周期较长,常用于细胞以及临床治疗细胞的支原体检査;

荧光染色法是用特异荧光染料(Hoechst 33258)染色后在荧光显微镜下进行检测,荧光染料(Hoechst 33258)是一种能和DNA特异结合物质,如果检测样品为支原体污染,则附在细胞表面和分散在细胞与细胞之间的支原体DNA着色,在荧光显微镜下可见;

PCR法检测是通过对支原体特定的序列设计引物,当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增,会将目标DNA特异性的复制,然后通过琼脂糖电泳观检测,会跑出条带出现阳性结果,反之当没有支原体污染时,由于没有模板,PCR无法扩增,则琼脂糖电泳跑不出条带,出现阴性结果;电镜观察法是利用电子显微镜的超级放大功能,直接观察培养细胞中支原体污染情况。

在此主要介绍利用荧光染色法来检测培养细胞中的支原体,具体检测步骤如下:

(1)细胞爬片培养:待测细胞培养至传代水平,将细胞消化后接种至含有玻片的细胞板中,培养至60%-70%汇合时,进行检测;

(2)漂洗:将细胞板中的培养液吸出,取出玻片,用PBS轻轻漂洗;

(3)固定:加入适量的固定液,室温放置10min;

(4)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次;

(5)染色:加入适量的荧光染料(Hoechst 33258)工作液,在室温下放置10min;

(6)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次;

(7)镜下观察:将玻片晾干后,滴加抗荧光猝灭剂,于荧光显微镜下观察、拍照;